BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOBỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
KHÚC CHÍ HIẾU
TÍNH DỊ HÌNH CỦA MỘT SỐ NST Ở CÁC THAI ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BÌNH THƯỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2010 – 2016
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Giảng viên: TS. BS. Đoàn Thị Kim Phượng
Hà Nội – 2016
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin chân thành cám ơn đến quý thầy cô bộ môn Y sinh học di truyền trường đại học Y Hà Nội, những người đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn và cũng là những người đã giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.
Đặc biệt tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đoàn Thị Kim Phượng người đã hết lòng giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi ngay từ những giai đoạn đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới:
Các thầy cô hội đồng bảo vệ đề cương khóa luận đã đóng góp những nhận xét quý báu để khóa luận được hòa thiện và giúp tôi có thêm kinh nghiệm trong những nghiên cứu khoa học về sau.
Những người bạn đã bên cạnh giúp đỡ và động viên tôi lúc khó khăn trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình tôi, những người luôn luôn là chỗ dựa về tinh thần trong suốt quá trình học tập cũng như tham gia thực hiện đề tài nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2016
KHÚC CHÍ HIẾU
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Đoàn Thị Kim Phượng. Các kết quả và số liệu nghiên cứu đưa ra trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2016
KHÚC CHÍ HIẾU
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠNi
LỜI CAM ĐOANii
MỤC LỤCiii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTv
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒvi
ĐẶT VẤN ĐỀ1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU3
1.1.Đặc điểm chung về bộ NST bình thường ở người3
1.2.Các dạng rối loạn NST9
1.3.Vùng dị nhiễm sắc và vùng nhiễm sắc thực10
1.4.Hiện tượng dị hình nhiễm sắc thể11
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU16
2.1. Đối tượng nghiên cứu16
2.2. Phương pháp nghiên cứu17
2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu18
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU19
3.1. Tỉ lệ dị hình của một số NST19
3.2. Liên quan giữa tính dị hình NST và giới tính thai20
3.3. Mối liên quan giữa tính dị hình NST với chỉ định chọc ối22
Chương 4: BÀN LUẬN25
4.1. Tỉ lệ dị hình NST25
4.2. Mối liên quan giữa tính dị hình và giới tính thai30
4.3. Mối liên quan giữa tính dị hình và các chỉ định chọc ối31
KẾT LUẬN33
1. Tỉ lệ NST dị hình trong nhóm thai được chẩn đoán trước sinh bình thường33
2. Mối liên quan giữa dị hình NST và giới tính33
3. Mối liên quan giữa dị hình NST và chỉ định chọc ối33
KIẾN NGHỊ34
TÀI LIỆU THAM KHẢO35
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
NST Nhiễm sắc thể
D Nhiễm sắc thể nhóm D
G Nhiễm sắc thể nhóm G
1qh+ Tăng vùng dị nhiễm sắc nhánh dài NST 1
9qh+/- Tăng giảm vùng dị nhiễm nhánh dài NST 9
16qh+/- Tăng giảm vùng dị nhiễm nhánh dài NST 16
Yq+/- Dị hình tăng giảm nhánh dài NST Y
SLNCD Sàng lọc nguy cơ Down
SABT Siêu âm chẩn đoán trước sinh bất thường
TSDTBT Có tiền sử di truyền bất thường
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH
Bảng 2.1: Tổng hợp các biến số nghiên cứu19
Bảng 3.1: Tỉ lệ NST dị hình chung20
Bảng 3.2: Tỷ lệ từng dạng dị hình NST20
Bảng 3.3: Tỷ lệ NST dị hình theo giới tính23
Hình 1.1: Phân loại NST4
Hình 1.2: Karyotyp của nam giới5
Hình 1.3: Cấu trúc vùng dị nhiễm sắc và vùng nhiễm sắc thực11
Hình 1.4: Một số dạng NST dị hình13
Hình 3.1: Biểu đồ phân bố các dạng dị hình NST21
Hình 3.2: Biểu đồ phân bố giới tính thai tham gia nghiên cứu22
Hình 3.3: Phân bố giới tính của các thai mang NST dị hình22
Hình 3.4: Biểu đồ phân bố tỉ lệ các chỉ định chọc ối23
Hình 3.5: Tỉ lệ dị hình theo từng chỉ định chọc ối24
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua di truyền y học có sự phát triển mạnh mẽ về cả chiều sâu lẫn chiều rộng. Những thành tựu này đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau của y học.
Di truyền y học nghiên cứu dưới 2 cấp độ cơ bản là tế bào và phân tử [1]. Ở cấp độ phân tử di truyền y học nghiên cứu về ảnh hưởng, vai trò và ứng dụng của các gen trong chẩn đoán và điều trị bệnh lý . Ở cấp độ tế bào, chúng ta cũng đã biết các rối loạn liên quan đến nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến kiểu hình. Đó thường là các biến đổi về số lượng NST hoặc cấu trúc NST gây ra bệnh tật hay nguy cơ mắc bệnh như nguy cơ ung thư, nguy cơ sảy thai, thai chết lưu ở các thai phụ qua đó chúng ta có thể sàng lọc trước cũng như có biện pháp tư vấn thích hợp đối với các đối tượng có nguy cơ cao. Tuy nhiên, bên cạnh những rối loạn nhiễm sắc thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kiểu hình đã nói thì có một biến đổi về hình thái NST đến nay người ta vẫn chưa rõ tác động của nó với bệnh tật hay sức khỏe của con người, đó là hiện tượng dị hình (heteromorphism) của 1 số NST xuất hiện ở một số cá thể trong quần thể người
Trước đây tính dị hình của NST được biết đến như là những biến đổi bình thường và không có sự tác động lên kiểu hình, hiện tượng này thường được quan sát thấy rõ ở NST số 1,9, 16 hay NST giới tính Y. Tuy nhiên trong những nghiên cứu gần đây đã cho thấy có mối liên quan giữa dị hình của NST với hiện tượng xảy thai và thai chết lưu [2], [3]. Mặt khác, các nghiên cứu trước đây được thực hiện trên những nhóm người thuộc các chủng tộc khác nhau và đã cho các kết quả khác nhau về tỉ lệ dị hình NST [4].
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được công bố về các đặc điểm tính dị hình của NST. Để tạo cơ sở cho những nghiên cứu về ảnh hưởng của tính dị hình về sau, chúng tôi thực hiện nghiên cứu :“ Tính dị hình của một số NST ở các thai được chẩn đoán trước sinh bình thường ”
Thực hiện nghiên cứu này chúng tôi có ba mục tiêu là :
Xác định tỉ lệ một số dạng dị hình NST thường gặp ở các thai được chẩn đoán trước sinh.
Xác định mối liên quan giữa tính dị hình NST với giới tính thai.
Xác định mối liên quan giữa tính dị hình NST với các chỉ định chọc ối.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Đặc điểm chung về bộ nhiễm sắc thể bình thường ở người
Nhiễm sắc thể
Nhiễm sắc thể (NST) là một cấu trúc nằm trong nhân tế bào, được cấu tạo bởi sợi nhiễm sắc (chromatin), đó là phức hợp giữa DNA và protein. Trong nhân tế bào, chất nhiễm sắc tồn tại thường xuyên dưới dạng sợi nhiễm sắc mảnh , khó quan sát. Khi bước vào thời kì phân bào, sợi nhiễm sắc bắt đầu đóng xoắn và đạt độ nén cực đại ở kỳ giữa. Lúc này, nhiễm sắc thể (chromosome) dày hơn và đã ở dạng kép gồm hai nhiễm sắc tử (chromatid) đính nhau ở tâm động (centromere), chúng có hình dạng và kích thước đặc trưng nên có thể quan sát và đếm số lượng thông qua kính hiển vi quang học.
Khi sử dụng kĩ thuật nhuộm băng G, trên NST hiện lên các dải vạch có độ đậm nhạt khác nhau. Đó là do sự bắt màu khác nhau của vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) và vùng nhiễm sắc thực (euchromatin) [5].
Phân loại NST
Việc xác định và phân loại từng NST được thực hiện dựa trên các đặc điểm sau đây của mỗi NST:
Kích thước (chiều dài) của NST. Chiều dài của NST giảm dần từ cặp số 1 đến đôi cặp 22. Cặp số 23 là NST giới tính.
Vị trí của tâm động (centromere): Tâm động chia NST làm hai nhánh được gọi là nhánh ngắn (nhánh p, p: petite) và nhánh dài (nhánh q). Tùy theo vị trí của tâm động trên NST mà chia thành ba loại:
NST tâm giữa (metacentric): tâm động nằm giữa, hai nhánh p và q tương đối bằng nhau.
NST tâm lệch (submetacentric): tâm động nằm lệch, sự khác biệt giữa nhánh p và q khá rõ.
NST tâm đầu (acrocentric): NST nằm ở một đầu của NST. Các NST tâm đầu thường có mang các vệ tinh (sattelite) nối với tâm động bằng các cuống.
Hình 1.1. Phân loại NST
Nguồn http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia
Sự phân bố của các band sáng tối (trong kỹ thuật nhuộm band).
Màu sắc huỳnh quang bắt màu trên NST (trong kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang) [6].
Karyotyp của người
Giai đoạn thích hợp để lập karyotype
Kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (prometaphase) của nguyên phân là giai đoạn NST cho hình ảnh rõ nét nhất giúp đánh giá số lượng và cấu trúc của các NST một cách dễ dàng.
Hình 1.2. Karyotyp của nam giới
Nguồn http://www.genetika-biologie.cz/karyotyp-cloveka
Loại tế bào được sử dụng
Mô dùng để làm tiêu bản NST phải là những mô có nhiều tế bào đang phân chia: tủy xương, mô bào thai, tinh hoàn…
Những mô đã có nhiều tế bào đang phân chia có thể áp dụng phương pháp trực tiếp: làm tiêu bản NST ngay hoặc nuôi cấy ngắn hạn.
Những mô có ít tế bào đang phân chia phải áp dụng phương pháp nuôi cấy dài hạn, với các tiến trình nuôi cấy khác nhau tùy từng loại mô, loại tế bào. Một số trường hợp không còn tế bào đang phân chia người ta phải sử dụng phương pháp kích thích cho tế bào phân chia [1] .
Cách lập karyotype
22 cặp NST thường được chia thành 7 nhóm được ký hiệu bằng các chữ cái Latinh A, B, C, D, E, F, G. Mỗi nhóm gồm các NST có kích thước gần giống nhau và dễ nhầm lẫn với nhau khi phân loại. Các NST thường được sắp xếp theo kích thước từ lớn tới nhỏ dần và được đánh số từ 1 đến 22 và cặp NST giới tính được ký hiệu là XX (người nữ) và XY (người nam) được xếp riêng ở góc dưới phải của karyotype hoặc NST X được xếp theo nhóm C và NST Y được xếp theo nhóm G.
Các NST từ 1 đến 22 được sắp xếp theo dựa kích thước từ lớn đến nhỏ dần.
Nhóm A: Gồm 3 cặp số 1, 2, 3, đây là 3 cặp lớn nhất và có tâm giữa.
Nhóm B: Gồm 2 cặp số 4 và 5, đây là 2 cặp lớn có tâm lệch.
Nhóm C: Gồm 7 cặp số 6, 7, 8, 9 10, 11, 12 với chiều dài trung bình và tâm lệch.
Nhóm D: Gồm 3 cặp số 13, 14, 15 có chiều dài trung bình và tâm đầu.
Nhóm E: Gồm 3 cặp số 16, 17, 18 có chiều dài bé, các NST có tâm lệch hoặc tâm giữa.
Nhóm F: Gồm 2 cặp số 19 và 20 có chiều dài bé và tâm lệch.
Nhóm G: Gồm 2 NST 21 và 22 có chiều dài bé và tâm đầu.
NST X giống các NST của nhóm C và NST Y giống NST của nhóm G.
Các kĩ thuật băng và cách gọi tên băng
NST được phân tích dựa trên việc nuôi cấy mô (thường là máu ngoại vi) trong các điều kiện và thời gian thích hợp (thường từ 48 đến 72 giờ đối với tế bào lympho trong máu ngoại vi). Colcemid được sử dụng để làm ngừng quá trình phân bào ở kỳ giữa nguyên phân. Sau đó các tế bào được xử lý nhược trương để phá vỡ màng tế bào, lên tiêu bản, nhuộm bằng các loại thuốc nhuộm nhân và quan sát bằng kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần), các cụm NST được chụp ảnh và được sử dụng để lập karyotype.
Hiện nay với việc sử dụng các chương trình vi tính chuyên dụng việc lập karyotype được thực hiện nhanh chóng và hiệu quả hơn.
Các kĩ thuật nhuộm
Để có thể đánh giá được các bất thường NST về số lượng và cấu trúc, nhiều kỹ thuật nhuộm đã được sử dụng để hiển thị các NST.
Kỹ thuật nhuộm band G (G-band): nhuộm band NST bằng thuốc nhuộm Giemsa sau khi đã xử lý NST bằng Trypsin. Đây là phương pháp nhuộm được sử dụng rộng rãi để đánh giá các bất thường của NST về số lượng và cấu trúc.
Kỹ thuật nhuộm band Q (Q-band): nhuộm NST bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật cho hiển thị band tương tự như nhuộm band G.
Kỹ thuật nhuộm band R (reverse band, R-band): đòi hỏi phải xử lí NST bằng nhiệt trước khi nhuộm. Kỹ thuật này cho phép hiển thị các band sáng tối ngược với phương pháp nhuộm band Q và G tạo thuận lợi cho việc đánh giá các bất thường ở các đầu cùng của NST.
Kỹ thuật nhuộm band C (C-band): cho phép nhuộm và đánh giá các vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) của tâm động.
Kỹ thuật nhuộm NOR (nucleolar organizing region): vùng cấu tạo nên hạch nhân) (NOR stain): cho phép nhuộm các vệ tinh và các cuống ở các NST tâm đầu.
Kỹ thuật nhuộm band G với độ phân giải cao (high resolution banding): NST được nhuộm khi đang ở kỳ đầu (prophase) hoặc vào giai đoạn sớm của kỳ giữa (prometaphase) sau khi xử lí bằng các hóa chất thích hợp, do đó tổng số band của NST có thể tăng lên đến 800 band cho phép phát hiện các bất thường nhỏ trong cấu trúc của các NST.
Kỹ thuật FISH (fluorescence insitu hybridization): lai tại chỗ bằng kỹ thuật huỳnh quang): Một đoạn DNA được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với một vị trí trên NST đóng vai trò của một đoạn dò (probe) đem lai với các NST ở kỳ giữa, giai đoạn sớm của kỳ giữa, kỳ đầu hoặc gian kỳ rồi sau đó quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phát hiện các trường hợp xảy ra tình trạng mất đoạn NST, thừa NST hoặc tái sắp xếp NST như chuyển đoạn. Kỹ thuật đòi hỏi tính đặc hiệu cao của các DNA dò và định định hướng trong chẩn đoán lâm sàng.
Kỹ thuật lập karyotype quang phổ (SKY: spectral karytotype): Đây là kỹ thuật nhuộm sử dụng sự phối hợp của 5 loại màu huỳnh quang khác nhau. với 5 màu khác nhau sẽ có thể tạo ra nhiều màu khác nhau cho phép tạo nên đủ số probe cho 22 NST thường và 2 NST giới tính X và Y. Với kỹ thuật này mỗi NST sẽ có một dải màu đặc hiệu sau khi sử dụng hệ thống chụp ảnh và phần mềm xử lí ảnh đặc hiệu sẽ làm cho việc đánh giá các bất thường về số lượng và một số loại bất thường cấu trúc của NST một cách hiệu quả [7].
Danh pháp
Dưới đây là các danh pháp được sử dụng phổ biến trong việc mô tả NST trong karyotype:
A-G : Các nhóm NST
1-22: Số của các NST
X, Y: Các NST giới tính
/ : Ký hiệu để minh họa trạng thái khảm (vd: 46/47 mô tả cơ thể ở trạng thái khảm với 2 dòng tế bào 46 và 47 NST.
p : Nhánh ngắn của NST
q : Nhánh dài của NST
del : Mất đoạn (deletion)
dup : Nhân đoạn (duplication)
i : NST đều (isochromosome)
ins : chèn đoạn (insertion)
inv: : Đảo đoạn (inversion)
r : NST hình vòng (ring chromosome)
t : Chuyển đoạn (translocation)
ter : Đầu tận cùng (cũng có thể được viết pter hoặc qter để mô tả đầu tận cùng của nhánh ngắn hoặc nhánh dài).
Dấu (+) hoặc (-) đứng trước số của NST để minh họa hiện tượng thừa hoặc thiếu NST đó.
Các dạng rối loạn NST
Bất thường số lượng NST
Đa bội
Trong các tế bào sinh dưỡng dưỡng của thể đa bội, bộ NST lớn hơn 2n do bộ NST được tang một số chẵn hoặc lẻ lần, ví dụ 3n, 4n…
Có 3 cơ chế có thể dẫn đến hiện tượng đa bội:
Thụ tinh của các giao tử bất thường.
Sự phân chia bất thường của hợp tử.
Sự thụ tinh kép hoặc sự xâm nhập của tế bào cực.
Lệch bội
Lệch bội là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài NST so với bộ NST lưỡng bội [8], [9].
