10396_Nghiên cứu bào chế Liposome Doxorubicin 2mg-ml bằng phương pháp pha loãng Ethanol

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHA LOÃNG ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHA LOÃNG ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
Ths. Nguyễn Văn Lâm
Nơi thực hiện
Bộ môn Bào chế
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược
Hà Nội và bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt giúp đỡ em hoàn
thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua.
Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến
ThS. Nguyễn Văn Lâm
Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận
tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế,
trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan
tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thu Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
…………………………………………………………………..
6
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU …………………………………………………………………….
7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ……………………………………………………………
8
ĐẶT VẤN ĐỀ ……………………………………………………………………………………………….
1
Chương 1. TỔNG QUAN
……………………………………………………………………………….
2
1.1. Doxorubicin …………………………………………………………………………………………
2
1.1.1. Đại cương về doxorubicin ………………………………………………………………..
2
1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường …………………………………….
3
1.2. Đại cương về liposome ………………………………………………………………………….
4
1.2.1. Khái niệm ………………………………………………………………………………………
4
1.2.2.1. Ưu điểm
……………………………………………………………………………………
4
1.2.2.2. Nhược điểm ………………………………………………………………………………
5
1.2.3. Phân loại ……………………………………………………………………………………….
6
1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp …………………………………………………………..
6
1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ ………………………………………………………………….
6
1.2.4. Phương pháp bào chế
………………………………………………………………………
7
1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn ………………………………………………………
7
1.2.4.2. Phương pháp Bangham ……………………………………………………………..
8
1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham
……………………………………………..
8
1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol …………………………..
9
1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin …………………………………………..
11
1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới …………………..
11
1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam ………………….
12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………..
14
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu …………..
14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
…………………………………………………………………….
14
2.1.2. Nguyên vật liệu
……………………………………………………………………………..
14
2.1.3. Phương tiện nghiên cứu …………………………………………………………………
14
2.2. Phương pháp nghiên cứu
……………………………………………………………………..
15
2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin
…………………………………….
15
2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin …………………………………..
15

2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố
kích thước tiểu phân
…………………………………………………………………………….
15
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu
suất liposome hóa………………………………………………………………………………..
16
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
………………………………………………………………
17
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm
………………………………………………………………………
17
Chương 3. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN……………………………………
18
3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn …………………………………………………………….
18
3.2. Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp
pha loãng ethanol ……………………………………………………………………………………..
19
3.2.1. Quy trình bào chế chung ………………………………………………………………..
19
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế
đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa …………………………………..
20
3.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi …………………………………………………..
20
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ……………………………………………………………
24
3.2.3. Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy
trình bào chế
………………………………………………………………………………………….
27
3.2.3. Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome
doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol
…………………………..
29
3.2.3.1. Quy trình bào chế
…………………………………………………………………….
29
3.2.3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra ……………………………..
30
3.3. Bàn luận
…………………………………………………………………………………………….
32
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
…………………………………………………………..
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………………….
38

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
CHL
Cholesterol
2
HSPC
Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa
3
SPC
Phosphatidylcholin dầu đậu nành
4
HEPES
Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan
sulfonic acid
5
PDI
Chỉ số đa phân tán
6
DOX
Doxorubicin
7
DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid
8
KTTP
Kích thước tiểu phân
9
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
10
TKKH
Tinh khiết hóa học
11
USP
Dược điển Mỹ
12
DĐVN
Dược điển Việt Nam
13
TMT-LS
Liposome tác động vào khối u di căn
14
EE
Hiệu suất liposome hóa
15
PEG
Polyethylen glycol

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 2.1
Các nguyên vật liệu được sử dụng.
14
Bảng 3.1
Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở
bước sóng 233 và 481 nm (pH 4).
18
Bảng 3.2
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến
KTTP và hiệu suất liposome hóa.
20
Bảng 3.3
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP
liposome.
21
Bảng 3.4
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất
liposome hóa.
23
Bảng 3.5
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP
và hiệu suất liposome hóa.
25
Bảng 3.6
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome
hóa
25
Bảng 3.7
So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome
doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau
27
Bảng 3.8
Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và
hiệu suất liposome hóa
28
Bảng 3.9
Kết quả KTTP và hiệu suất liposome hóa
31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Số hiệu
Tên các hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1
Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid.
2
Hình 1.2
Cấu trúc liposome.
4
Hình 1.3
Kích thước một số loại liposome.
6
Hình 1.4
Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng.
9
Hình 3.1
Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin.
18
Hình 3.2
Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác
nhau.
21
Hình 3.3
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi PDI (A) và KTTP (B) theo tỷ lệ
dung môi.
21
Hình 3.4
Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích các mẫu trước (A) và sau
(B) lọc tiếp tuyến.
24
Hình 3.5
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất
liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi.
23
Hình 3.6
Đồ thị biểu diến sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất
liposome hóa (B) theo nhiệt độ.
26
Hình 3.7
Sơ đồ quy trình bào chế.
30
Hình 3.8
Ảnh chụp TEM liposome.
31

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều
ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa
trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích. Trong bào
chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên
thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế
bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược
chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm
chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc
biệt để đạt tác dụng hướng đích…
Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được
đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc
tiêm liposome doxorubicin. Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn
nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Các nghiên cứu về
liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy
nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không
đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi
trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy
mô công nghiệp…
Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược
điểm của phương pháp nói trên. Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome
doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục
đích:
1. Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol.
2. Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra.

2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Doxorubicin
1.1.1. Đại cương về doxorubicin

Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid
– Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl)
oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5,
12-napthacenedion [22].
– Tính chất: điều kiện thường tồn tại ở dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng
cam không mùi, tan trong nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran. Không tan
trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22].
– Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [10].
– Doxorubicin là chất nhạy cảm với ảnh sáng ở nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ
điều trị doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng, không nhất
thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ. Thực tế dung dịch doxorubicin trong NaCl
0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25oC, lâu hơn khi
bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4oC [22].
– Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để
sao chép và phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở
giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân [2].
– Dược động học: sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến
các mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol.
– Công thức phân tử:
C27H29NO11. HCl.
– Khối lượng phân tử:
579,99.

3

Khoảng 40 – 50% bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5%
bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày. Doxorubicin không qua hàng rào máu não
nhưng qua nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa [2], [5], [22].
Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do.
Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần
hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn. Các liposome doxorubicin phân bố
nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường. Dạng liposome doxorubicin
không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương
cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [5], [22].
– Chỉ định chính: ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing,
u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin,
ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thư đường tiết niệu và sinh
dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em:
Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp… [2].
Chỉ định tương đối: ung thư tuyến tiền liệt, cổ tử cung, âm đạo, dạ dày. Có tác dụng
tốt trên một số ung thư hiếm gặp như đa uy tủy xương, u màng hoạt dịch, u nguyên
bào võng mạc [2], [22].
– Chống chỉ định: có biểu hiện suy giảm chức năng tủy xương rõ, suy tim, quá mẫn
với các thành phần của thuốc [2], [22].
– Tác dụng không mong muốn: độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng và
tần số dùng thuốc. Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng tóc, buồn nôn,
đặc biệt là chèn ép tủy và độc tính trên tim. Ngoài ra còn gặp một số tác dụng phụ
khác như: suy giảm chức năng tủy xương, viêm miệng, rối loạn tiêu hóa, nóng rát
bàng quang và niệu đạo… [2], [22].
1.1.2. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
– Chế phẩm dạng quy ước:
+ Dung dịch tiêm: Adorucin, Adriamicin, Adrim, Doxorubicin DBL, Doxorubicin
Ebewe…
+ Bột pha tiêm: Adriblastina, Doxorubicin, Doxorubicin sevycal, Doxtie, Zodox…
4

– Chế phẩm dạng liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet…
1.2. Đại cương về liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là một dạng đặc biệt của vi nang, bao gồm một vỏ phospholipid kép có
đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước
ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến
hàng ngàn nanomet [4].

Hình 1.2. Cấu trúc liposome [8].
1.2.2. Ưu nhược điểm của liposome
1.2.2.1. Ưu điểm
– Phospholipid là tá dược phân giải sinh học cao, không độc với cơ thể, không gây
đáp ứng miễn dịch khi đưa vào tuần hoàn do vậy liposome được coi là hệ vận chuyển
thuốc có tính tương hợp sinh học cao nhất [23].
– Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân nước và dược chất thân dầu.
Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước
và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [18].
– Cấu tạo và tính chất hóa lý tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm
qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của dược chất, mang các dược chất chữa bệnh nội
bào [3], [4].
5

– Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức
bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome do đó làm
thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [23].
– Làm thay đổi phân bố sinh học của một số dược chất có độc tính cao, dùng liều
thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn do đó làm giảm phân bố thuốc tại
cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với dược chất tự do, làm giảm độc tính và tác
dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm dược chất [3], [4], [23].
– Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi
của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng
trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa… làm tăng độ tan của dược chất hoặc kéo
dài tác dụng của thuốc [3], [4].
1.2.2.2. Nhược điểm
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng liposome hiện nay vẫn chưa được sử dụng rộng
rãi do một số nhược điểm sau:
– Phospholipid không bền về mặt hóa học nên tuổi thọ của liposome ngắn.
Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài [4].
– Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong quá
trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự thống nhất giữa các lô mẻ nên khó triển khai
sản xuất lớn [4].
– Tỷ lệ liposome hóa của dược chất thấp, khó mang dược chất có phân tử lượng
lớn [4].
– Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó rất
khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có thể lẫn các
lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [21].
– Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa
tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [26].
– Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô phòng
thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn [21].
6

– Hiện chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome. Ví
dụ như hội chứng tay chân (Hand and foot syndrome) không xuất hiện khi sử dụng
doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin
tuần hoàn kéo dài [21].
1.2.3. Phân loại

1.2.3.1. Theo kích thước và số lớp [11] Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng
trục (MLV), liposome kép (liposome
trong liposome – MVV), Liposome đơn
lớp lớn (LUV), Liposome đơn lớp nhỏ
(SUV), Liposome đơn lớp khổng lồ
(GUV), Liposome đa lớp nhỏ (OLV)…

Hình 1.3. Kích thước một số loại liposome [5] 1.2.3.2. Theo cấu trúc lớp vỏ
– Liposome quy ước: cấu tạo gồm có vỏ lipid và nhân nước. Nhược điểm: thời gian
tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả
năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các
tế bào bình thường [1], [5], [7].
– Liposome hiện đại: Cấu trúc được thay đổi để khắc phục nhược điểm của
liposome quy ước nhằm tạo ra một hệ mang thuốc hiệu quả gồm:
+ Liposome gắn các yếu tố ổn định (long circualating liposomes): độ ổn định cao,
thời gian tồn tại trong tuần hoàn từ vài ngày đến hàng tuần [4], [5], [7], [20].
+ Liposome miễn dịch (immune liposomes): bề mặt gắn kháng thể, có khả năng
liên kết với receptor đặc trưng tại cơ quan đích, có thể giải phóng dược chất tại ngoại
bào gần tế bào đích [4], [5], [7], [20].
+ Liposome miễn dịch tồn tại lâu trong tuần hoàn (long circulating immune
liposomes): liposome kết hợp ưu điểm của liposome tồn tại lâu trong tuần hoàn và
7

liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome
[1], [4].
+ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome) [1], [4].
+ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) [1], [4].
+ Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển
gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [4].
+ Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp
ứng miễn dịch cho cơ thể [4], [13].
+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat
hóa tạo hỗn dịch liposome [4].
+ Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol,
isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [4].
+ Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế
từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri
cholat,…) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong
mỹ phẩm. Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là
transferosome [4].
+ Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid. Độ ổn
định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome.
Niosome gần đây được phát triển như một chất mang thuốc tương tự liposome, cải
thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược
chất kém bền [4].
+ Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho
phosphonolipid, dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng
độc tính với tế bào ung thư và đơn bào [4].
1.2.4. Phương pháp bào chế
1.2.4.1. Phương pháp Batzri và Korn (pha loãng ethanol)
Được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng
ethanol hay tiêm ethanol. Quy trình bào chế gồm các bước: Hòa tan phospholipid và
8

các thành phần tạo màng vào ethanol. Bơm nhanh dung dịch này vào môi trường
nước hoặc hệ đệm, kết hợp khuấy trộn. Do thay đổi dung môi sẽ tạo thành các SUV
có kích thước khoảng 25 nm. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome. Liposome
thu được có kích thước nhỏ (30-110 nm) khá đồng nhất mà không phải trải qua quá
trình siêu âm [3], [4], [17], [19].
1.2.4.2. Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film)
Do Bangham đưa ra từ năm 1965, với các bước tiến hành: Hòa tan phospholipid
và các thành phần tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (chloroform, methanol…).
Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay tạo màng mỏng phospholipid
bám trên thành bình cất. Thêm dung dịch nước có hệ đệm (như hệ đệm phosphat pH
7,0 – 7,4) vừa cho vừa lắc để xảy ra quá trình hydrat hóa màng phospholipid tạo thành
liposome. Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển
pha của lipid Tc, thông thường từ 50 – 60oC. Dược chất được phối hợp vào liposome
theo cơ chế chủ động hoặc thụ động. Phương pháp này thu được liposome nhiều lớp,
kích thước không đồng nhất (từ 50-1000 nm) [3], [4], [19].
1.2.4.3. Phương pháp Deamer và Bangham (bơm ether)
Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 – 65oC.
Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ether. Bơm từ từ dung dịch ether vào
dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether sẽ bốc hơi tạo thành
liposome to một lớp có kích thước 200 – 1000 nm. Phương pháp tiến hành nhanh
nhưng hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi,
có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm [3], [4], [19].
Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác [4], [17]:
– Phương pháp bốc hơi pha đảo.
– Phương pháp đông khô.
– Phương pháp dùng chất diện hoạt.
– Phương pháp màng tiếp hợp.
– Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn.
– Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn.
9

1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol
So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có ưu
điểm nổi bật với quy trình bào chế đơn giản, dễ thực hiện, tạo ra các liposome có kích
thước nhỏ, tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm làm giảm
KTTP.
Quy trình bào chế liposome theo phương pháp pha loãng ethanol được bố trí rất
đơn giản: Lipid và các thành phần tạo màng với nồng độ phù được được hòa tan trong
ethanol, tiêm nhanh vào môi trường nước hoặc hệ đệm phù hợp kết hợp khuấy trộn ở
tốc độ phù hợp. Dược chất được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường
đệm phụ thuộc vào độ tan. Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25
nm được tạo thành. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [3], [4], [11], [19].
Phương pháp pha loãng ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống
kim phun nhằm khắc phục hạn chế, nâng cao quy mô bào chế. Pha nước, pha ethanol
được làm nóng tới 55oC. Pha nước được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang
(3), quay trở lại (2), trong quá trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha
ethanol có hòa tan phospholipid được bơm dưới áp lực nén của (5) qua thiết bị đầu
kim phun (1) [25].

Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng [25].
Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành có thể phụ thuộc vào các yếu tố: tốc
độ tiêm; nồng độ phospholipid trong dung dịch ethanol và trong dung dịch đệm;
đường kính bơm kim tiêm, áp suất bơm; pH và áp suất thẩm thấu dung dịch đệm; tốc
1. Hệ thống kim phun
(2, 3). Pha nước
4. Pha ethanol
5. Thiết bị nén khí nito
6. Bơm nhu động

10

độ khuấy trộn; tỷ lệ thể tích ethanol/đệm…[4], [17].Trong nghiên cứu về ảnh hưởng
của các yếu tố trên được tiến hành bởi Kremer và cộng sự năm 1977 đã chỉ ra rằng
tốc độ tiêm không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome [17].
Một số dung môi thân nước có thể thay thế cho ethanol như propanol, isopropanol,
ethyl acetat… Đặc biệt trong trường hợp ethanol ảnh hưởng đến độ ổn định của dược
chất [12].
Dược chất được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất đa dạng như
enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolon [17], beclomethason với
hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [14]. Dược chất có thể gắn theo cơ chế thụ động:
dược chất thân nước được hòa tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hòa tan
trong ethanol. Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động: thường áp dụng với dược chất
thân nước. Theo cơ chế thụ động dược chất thân dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome
rất cao (~100%), hiệu suất gắn của dược chất thân nước rất thấp (~16%). Kích thước
và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất. Từ đó
cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa dược chất
thân dầu [15].
Bên cạnh đó, phương pháp pha loãng ethanol còn tồn tại nhiều hạn chế như: giới
hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol (40mM đối với phosphatidylcholin) và
tỷ lệ thể tích ethanol/pha đệm (≤ 7,5 v/v) do đó liposome thu được thường bị pha
loãng; hiệu suất liposome hóa thấp đặc biệt với các dược chất thân nước, dung môi
ethanol tồn dư cần được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách…[4], [17], [19].
Phương pháp pha loãng ethanol hiện được ứng dụng nhiều trên thế giới, được sử
dụng nhiều trong các nghiên cứu bào chế liposome.
Năm 2008, Johnston Micheal J. W. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome
DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol. Các lipid được sử dụng là disteroyl
phosphatidylcholin, cholesterol, spingomyelin trứng được hòa tan trong ethanol, bơm
vào dung dịch MgSO4 để tạo liposome. Lọc ép 10 lần qua màng polycacbonat 100
nm thu được liposome có kích thước 110 nm ± 25 nm. Dược chất DOX được hòa tan
thành dung dịch rồi phối hợp vào liposome ủ trong 90 phút ở 65oC. Các tác giả đã
11

tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ lipid – thuốc đến khả năng giải phóng thuốc
và sự toàn vẹn của liposome trong công thức liposome DOX. Kết quả nghiên cứu chỉ
ra rằng DOX có thể gắn vào liposome để đạt giá trị D/L cao đến 0,46%. Tỷ lệ thuốc
được giải phóng từ liposome có thể thay đổi trong một khoảng rộng tương ứng với
sự thay đổi các giá trị D/L và sự liposome hóa. Đồng thời nghiên cứu cũng chỉ ra rằng
nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và làm vỡ màng liposome là do sự lắng
thuốc ở các cấu trúc bên trong liposome [16].
Năm 2010, Chiraz Jaafar – Maalei đã cải tiến phương pháp tiêm ethanol bằng cách
sử dụng thêm một màng liên kết để bào chế liposome với dược chất indomethacin và
beclomethason, khảo sát một số yếu tố như dòng chảy pha nước, nồng độ
phospholipid…Hiệu suất liposome hóa thu được với indomethacin là 63%,
beclomethason 93%, kích thước giao động trong khoẳng 50 – 160 nm [14].
Philippe Gentine năm 2011 đã tiến hành nghiên cứu một số dung môi thân nước
thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp pha loãng ethanol như propanol,
butanol, isopropanol, ethyl acetat… Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol tạo liposome
có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), chỉ số đa phân tán PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và
không phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ phospholipid, thể tích
dung môi, tốc độ bơm, tốc độ khuấy trộn. Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol
để thay thế cho ethanol trong sản xuất liposome [12].
1.4. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin
1.4.1. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới
Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều sự
quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học.
Zhaohui Wang và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch
gắn peptid hướng đích trong điều trị ung thư di căn (TMT-LS) sử dụng liposome có
gắn một peptid hướng đích di căn ung thư cụ thể. Liposome được bào chế bằng
phương pháp hydrat hóa film (SPC: CHL: DSPE PEG = 20: 10: 2) hydrat hóa bằng
123mM amoni sulfat, siêu âm trong 30 phút sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-50
thu lấy các liposome có kích thước 100 nm, nạp DOX nhờ phương pháp tạo chênh
12

lệch pH, tinh chế liposome bằng phương pháp lọc trên gel. Sau quy trình bào chế thu
được các TMT-LS có kích thước 94,41 ± 0,1 nm, hiệu suất liposome hóa gần 100%.
Phân tích qua đo dòng tế bào cho thấy nồng độ TMT-LS-DOX tập trung tại dòng tế
bào ung thư di căn (MDA-MB-435S và MDA-MB-23J) cao hơn hẳn so với LS-DOX
trong khi đó không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ dược chất tại khối u giữa
TMT-LS-DOX và LS-DOX ở dòng tế bào ung thư không di căn (MCF-7). Sau 14
ngày, kích thước khối u từ 6,6 ± 1,57 cm giảm xuống 3,63 ± 0,37 cm khi điều trị bằng
LS-DOX và 1,71 ± 0,33 cm khi sử dụng TMT-LS-DOX [24].
Antonella Accardo và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng của liposome DOX gắn nhóm peptid MonY-BN tới các receptor bombesin tại
tế bào ung thư (DSPC-MonY-BN-DOX). Liposome với thành phần bao gồm DSPC
và MonY-BN (tỷ lệ mol 97: 3) được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo,
được đùn qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 100 nm nhờ áp suất khí Nitơ tạo
ra liposome đường kính 145,5 ± 31,5nm và chỉ số đa phân tán PDI 0,2 ± 0,05, thế
Zeta -12,8 ± 3,6mV. Nạp DOX bằng phương pháp chênh lệch pH sử dụng đệm
HEPES pH 7,4 bên ngoài liposome, hiệu suất liposome hóa 95,0 ± 2,7%. Liposome
DSPC/MonY-BN tập trung trong tế bào PC-3 là 2,7% ± 0,3% ở 37oC so với liposome
DSPC peptid tự do 1,4 ± 0,2%. Ở 37oC DSPC-MonY-BN-DOX ức chế sự phát triển
khối u cao hơn (60%) so với DSPC/ DOX liposome không đặc hiệu (36%) [9].
Từ một số nghiên cứu nói trên ta có thể nhận thấy rằng xu hướng hiện nay trên thế
giới là tập trung phát triển các dạng liposome nhạy cảm với điều kiện môi trường
hoặc có bề mặt gắn thêm các nhóm liên kết với kháng nguyên của tế bào u… nhằm
tăng tính hướng đích, tăng tác dụng điều trị, giảm tác dụng phụ.
1.4.2. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam
Năm 2011, Đào Thanh Tùng đã nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của
liposome DOX bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần tạo màng gồm có
SPC và CHL, dược chất được đưa vào liposome bằng hai phương pháp thụ động và
chủ động qua tạo chênh lệch pH qua màng. Kết quả đã khảo sát được công thức tỷ lệ
mol SPC: CHL (7:3), tỷ lệ mol dược chất: lipid (5:1) và xây dựng quy trình bào chế
13

liposome DOX với kích thước < 300 nm, hiệu suất liposome hóa > 80%. Hàm lượng
dược chất trong hệ phân tán~1mg/ml. Nghiên cứu bước đầu đã khảo sát và đưa ra
công thức bào chế liposome DOX tuy còn nhiều hạn chế như: liposome tạo ra có kích
thước lớn và không đồng đều bằng các nghiên cứu tham khảo trước đó, hiệu suất
liposome hóa chưa cao do sử dụng phương pháp tạo chênh lệch pH bằng cách điều
chỉnh pH thông thường sau khi hydrat hoá, do đó trong và ngoài liposome vẫn cùng
một hệ đệm [7].
Dựa trên cơ sở tiếp nối các kết quả thu được và khắc phục những hạn chế còn tồn
tại từ nghiên cứu của Đào Thanh Tùng, năm 2012 Nguyễn Văn Lâm đã tiến hành
nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm
và đánh giá tác dụng của chế phẩm trên khối u động vật. Liposome được bào chế
bằng phương pháp hydrat hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược
chất đưa vào liposome bằng phương pháp chủ động thông qua tạo chênh lệch pH giữa
hai bên màng bằng thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường
bên ngoài liposome. Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm. Liposome thu được có
KTTP < 200 nm, hiệu suất liposome hóa > 80%. TCCS cho thuốc tiêm liposome
DOX đã được đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW. Đánh giá tác
dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc
tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da. Tuy nhiên
nghiên cứu vẫn chưa giải quyết được những nhược điểm chung của phương pháp
hydrat hóa màng film (quy trình kéo dài, nhiều công đoạn, cần siêu âm làm giảm kích
thước tiểu phân…) [5].

14

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
– Liposome.
– Liposome DOX.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng.
STT Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu
chuẩn
1
Doxorubicin hydroclorid
Ấn Độ
USP
2
Cholesterol
Sigma Aldrich
USP
3
Phosphatidylcholin dầu đậu nành
đã hydrogen hóa (HSPC)
Lipoid
USP
4
Ethanol tuyệt đối
Trung Quốc
TKHH
5
Acid citric
Trung Quốc
TKHH
6
HEPES
(N-2-hydroxy ethyl piperazin – N –
2 – ethan sulfonic acid)
Mỹ
USP
7
Kali dihydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
8
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether))
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
9
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ TCCS
10
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
11
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH
12
Dung dịch tiêm truyền glucose 5%
Việt Nam
DĐVN

2.1.3. Phương tiện nghiên cứu
– Bể điều nhiệt (hãng Buchi-Đức).
– Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao Unidriver X1000.
– Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ
10kD, diện tích lọc 20cm2 (Mỹ).
15

– Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh).
– Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich-Đức).
– Máy quang phổ UV-VIS U-1800 (Hitachi-Nhật Bản).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin
2.2.1.1. Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất
Được tiến hành theo các nghiên cứu đã tham khảo trước đó [5]:
– Cân phosphatidylcholin và cholesterol (100: 30 kl/kl) hòa tan hoàn toàn trong
thể tích ethanol phù hợp.
– Chuẩn bị dung dịch đệm citrat 300mM pH 4.
– Phối hợp pha ethanol vào pha nước bằng loại bơm tiêm phù hợp, kết hợp khuấy
trộn và duy trì nhiệt độ thích hợp.
– Lọc tiếp tuyến để cô đặc hệ liposome về 10ml.
– Đổi môi trường bên ngoài liposome bằng phương pháp lọc tiếp tuyến sử dụng
đệm HBG (20mM HESPES / 1l dung dịch glucose).
2.2.1.2. Nạp dược chất
Dựa trên sự chênh lệch pH.
– Sau khi đổi đệm HEPES bên ngoài liposome, sự chênh lệch pH tạo động lực cho
quá trình nạp dược chất theo cơ chế chủ động.
– Cân chính xác lượng DOX.HCl để đạt hàm lượng 2mg/ml sử dụng thiết bị khuấy
từ để DOX hòa tan và khuếch tán vào trong liposome. Ủ trong 10p để khuếch tán
hoàn toàn.
– Liposome được đóng lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy và bảo quản ở 2 – 8oC.
2.2.2. Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin
2.2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước
tiểu phân
– Hình thức: liposome doxorubicin sau khi được bào chế phải là hỗn dịch đục mờ
màu đỏ cam, để lâu có thể bị lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ
16

– Hình dạng và cấu trúc liposome: sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền
qua với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome.
– KTTP và phân bố KTTP: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với
thiết bị Zetasizer ZS90. Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính
trung bình (Zaverage), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân
tán (PDI).
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất
liposome hóa
– Xây dựng đường chuẩn định lượng DOX tự do ở bước sóng 233 nm, DOX toàn
phần ở bước sóng 481 nm, xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu hiện tương quan
giữa mật độ quang và nồng độ DOX.
– Định lượng DOX toàn phần: tiến hành theo các nghiên cứu được tham khảo trước
đó [1], [7], với các giai đoạn chính:
+ Phá vỡ cấu trúc liposome bằng Triton 10%.
+ Pha loãng đến tỷ lệ thích hợp, đo quang ở 481 nm [1], [7].
+ Nồng độ DOX.HCL toàn phần tính theo công thức:
Ctp =
DTP
D’C × 𝐶′c × K’
DTP, D’C: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo.
CTP: hàm lượng DOX toàn phần của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml)
C’C: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml)
K’: Hệ số pha loãng.
– Định lượng DOX tự do bên ngoài liposome: tiến hành theo các nghiên cứu được
tham khảo trước đó [1], [7] theo các bước chính:
+ Lọc bằng túi thẩm tích để DOX tự do khuếch tán ra môi trường bên ngoài.
+ Hút dịch bên ngoài túi thẩm tích, pha loãng, đo quang ở 233 nm [1], [7].
+ Nồng độ DOX.HCl tự do được tính theo công thức:
CN =
DN
DC × 𝐶c × K
DN,DC: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo
17

CN: Hàm lượng DOX tự do của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml).
CC: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml).
K: Hệ số pha loãng.
– Hiệu suất liposome hóa (hàm lượng DOX được gắn vào liposome).
Tính theo công thức:
H =
CTP.V0 – CN.VN
CTP.V0
(%)
H: Hiệu suất liposome hóa.
CN, CTP: Hàm lượng DOX tự do và DOX toàn phần (mg/ml).
VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml).
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu:
– Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả theo giá trị trung bình. Các số liệu được
xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn S, ở mức tin cậy p = 0,95.
– Xử lý thống kê bằng phần mềm và Microsoft Office Excel.
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm
DOX là một chất có độc tính, không dễ khuếch tán hay bay hơi nhưng có khả năng
lây nhiễm qua dụng cụ, môi trường thí nghiệm và tiếp xúc trực tiếp. Các thí nghiệm
được tiến hành trong điều kiện:
– Khu vực thí nghiệm riêng biệt, tránh ánh sáng, được vệ sinh trước và sau làm thí
nghiệm. Có thiết bị bảo hộ cho người làm nghiên cứu.
– Trang thiết bị, dụng cụ dùng xong phải được xử lý riêng. Các dụng cụ được ngâm
với dung dịch sulfocromat để oxy hóa hết DOX.
– Các chất thải được ngâm với sulfocromat trước khi xử lý riêng.